厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

编号 zgly0001548637

文献类型 期刊论文

文献题名 厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化

作者 郭海磊  刘娜女  段晓雷  奚绪光 

作者单位 西北农林科技大学生命科学学院 

母体文献 西北农林科技大学学报(自然科学版 

年卷期 2017年06期

年份 2017 

分类号 Q55 

关键词 厌氧棒菌  Pif1解旋酶  蛋白表达纯化  DNA解旋活性 

文摘内容 【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌（Anaerobaculum hydrogeniformans）DNA解旋酶Pif1（AnaPif1）,研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21（DE3）中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移（FRET）技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性。【结果】成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95%的全长AnaPif1蛋白,其大小为55ku,等电点为6.89。AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl（pH7.0）20mmol/L、NaCl 20mmol/L、MgCl22mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸（ATP/GTP/CTP/UTP）作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物（双链DNA、G4-DNA）,且对底物选择无明显偏好性。【结论】获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征。