单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

编号 zgly0001576836

文献类型 期刊论文

文献题名 单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

作者 陈凤霞  叶精精  姜莉  王航  吕洁婷  罗微微  冯振灿  程昌勇  宋厚辉 

作者单位 浙江农林大学动物科技学院 

母体文献 动物医学进展 

年卷期 2018年03期

年份 2018 

分类号 S852.61 

关键词 单增李斯特菌  李斯特菌溶血素O  hly基因  同源重组  质粒回补 

文摘内容 单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌。李斯特菌溶血素O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析。以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段。经BamHⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒pKSV7中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得hly基因缺失株Δhly。同时,设计引物扩增含hly基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒pSL251,测序验证后电转至缺失株Δhly感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株CΔhly。测序结果显示,缺失株Δhly和回补株CΔhly均构建正确。利用Western blot方法检测突变株中LLO的表达情况,结果显示EGD-e和CΔhly中均能检测到LLO的正常表达,而Δhly中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础。