柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

编号 zgly0001528563

文献类型 期刊论文

文献题名 柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

作者 徐帅兵  黄兵  赵其平  董辉  朱顺海  崔晓霞  谢雨翔  唐敏  杨志远  韩红玉 

作者单位 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室  江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心  上海师范大学生命与环境科学学院 

母体文献 中国动物传染病学报 

年卷期 2016年06期

年份 2016 

分类号 S852.723 

关键词 柔嫩艾美耳球虫  子孢子  酵母双杂交cDNA文库  同源重组 

文摘内容 为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA),dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×107 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。